Giovanni Giustiniani Longo wurde im Jahr 1418 geboren. Giustiniani war ein Mitglied der mächtigen Familie Doria und stammte vermutlich von der Insel Chios.
Als Giovanni Giustiniani Longo von der Notlage der byzantinischen Hauptstadt erfuhr, segelte er zusammen mit 700 Männern aus Chios und Genua nach Konstantinopel, um die Stadt gegen die Osmanen zu verteidigen. Dort traf er Ende Januar 1453 ein, um sich auf die osmanische Belagerung vorzubereiten.
Auf Befehl des Kaisers Konstantin XI. übernahm Giustiniani die Landverteidigung der Stadt und beauftragte ihn mit der Ausbildung von Soldaten, der Verstärkung der Befestigungsanlagen und der allgemeinen Vorbereitung auf den bevorstehenden osmanischen Angriff.